Ачр принцип действия схема: Схемы АЧР и ЧАПВ | АЧР энергосистем

Содержание

1.2 Описание работы схемы ачр на базе реле рч-1.

Цель
работы
:
ознакомить студентов с работой простейшей
схемы АЧР, реализующей работу АЧР I
и с операциями по включению синхронного
генератора с выводом его на номинальные
параметры.

2.1
Программа выполнения лабораторной
работы
.

1.
Проверить на стенде положение тумблеров:
Т1, Т2, Т3 и Т4 – вверх, Т5,

Т6
и Т7 – вниз (рисунок 2.1) . Латры увеличения
оборотов синхронного генератора (TV)
и тока возбуждения TIВОЗБ
выведены (против часовой стрелки до
конца). На стенде включить автоматы
подачи питания SF1,
SF2
и SF3.

2.
Включить кнопку пуска SB1
и медленно увеличивать обороты латром
TIВОЗБ
до увеличения напряжения на вольтметре
PV3
до 230 в, и одновременно латром TIВОЗБ
поддерживать ток возбуждения на
амперметре PA3
не более 6А. При этом на частотомере PF
должна установиться частота на уровне
49,5-50 Гц. Включить тумблер «TV2
к РЧ – TV1
к Р922» в положение «TV2
к РЧ» (подключение обмоток реле частоты
РЧ-1 и РСГ11к цепям трансформатора
напряжения) и включить автомат питания
SF4
(подключение цепей оперативного тока
схемы АЧР).

3.
Включением дополнительной нагрузки
(нажатием на кнопки SB2
и SB3)
имитировать некоторое отключение
генерации, которое приводит к снижению
частоты до уставки запуска очередей
АЧР I.(2
очереди)

4.
В процессе работы схемы стенда отметить
очередность отработки первой и второй
очереди АЧР I
по сигнальным лампам ЛС1 и ЛС3 и момент
возврата схемы в исходное состояние
при повышении частоты уставок срабатывания
на возврат по сигнальным лампам ЛС2 и
ЛС4

5.
В отчете привести описание стенда и
операций по проведению работы с указанием
времени восстановления частоты после
имитации отключения генерации.

6.
Изучить работу схемы АЧР (рисунок 2.2)

7.
Изучить схему включения реле частоты
типа РСГ 11 (2РЧ на стенде) и способ
выставления уставок (рисунок 2.5)

8.
Изучить принципиальную схему реле
частоты типа РЧ1( 1РЧ на стенде) и способ
выставления уставок (рисунок 2.6,2.7

Рисунок
2.1- Стенд автоматической частотной
разгрузки (АЧР)

Рисунок
2.2 — Схема устройства автоматической
частотной разгрузки (обозначения
реле в скобках соответствуют наименованиям
реле на панели стенда)

Обозначения
реле на схеме в скобках (рисунок 2.2)
соответствуют обозначениям на панелях
лабораторного стенда.

При
понижении частоты до уставки 46,5 Гц
срабатывает реле 1KF(1РЧ)
и в цепи 1 замыкает контакт 1KF(1РЧ).
Срабатывает реле 3 КL
(3РП) и в цепи 2 замыкает контакты 3 КL
(3РП), а в цепи 7 размыкает контакты 3 КL
(3РП).

Срабатывает
реле времени 1КТ(1РВ) в цепи 2 и с
установленной выдержкой замыкает
контакт 1КТ(1РВ) в цепи 3. Срабатывает
первая обмотка двухобмоточного реле
1КL1(1РП1)
и перебрасывает свои контакты: размыкает
контакты 5-6 (цепь 3)и замыкает контакты
1-2 (цепь 10), 3-4 цепь 7), 7-8 (цепь 8). Замыкание
контактов 1-2 приводит к срабатыванию
реле 5 КL(5РП)
в цепи 10, контакты которого в цепи
включения выключателя YAT1
приводят к отключению некоторой
включенной нагрузки (которая была
введена кнопкой К1 при выполнении л.б.
При этом загорается лампа ЛС1.

Замыкание
контактов 3-4 в цепи 7 и 7-8 в цепи 8
подготавливает цепь возврата схемы в
исходное состояние.

Реле
частоты 2KF(2РЧ)
срабатывает при некотором повышении
частоты после отключения первой очереди
потребителей и отключает следующую
очередь с аналогичными действиями.

В
результате повышения частоты до исходной
реле частоты размыкаются. Реле 3 КL
(3РП) обесточивается и замыкает контакты
3 КL
(3РП) в цепи 7. Запускается реле времени
3КТ (оно не выведено на панель стенда) и
с некоторой выдержкой времени замыкает
контакт 3КТ в цепи 8. Это приводит к
срабатыванию второй обмотки реле
1КL2(1РП2),
которая перебрасывает свои контакты в
исходное состояние: включает контакты
5-6 в цепи 3 и отключает контакты 7-8 в цепи
8 и 1-2 в цепи 10. Аналогично работает схема
при отключении реле 4 КL
(4РП).

Схема
АЧР готова к работе.

2.3 Методические указания к выполнению лабораторной работе

2.3.1 Назначение и основные принципы выполнения ачр

Устройства
АЧР должны устанавливаться там, где
возможно возникновение значительного
дефицита активной мощности во всей
энергосистеме или в отдельных ее районах,
а мощность потребителей, отключаемых
при срабатывании устройства АЧР, должна
быть достаточной для предотвращения
снижения частоты, угрожающего нарушением
работы механизмов собственного расхода
электростанций, что может повлечь за
собой лавину частоты. Устройства АЧР
должны выполняться с таким расчетом,
чтобы была полностью исключена возможность
даже кратковременного снижения частоты
ниже 45 Гц, а время работы с частотой ниже
47 Гц не превышало 20 с, а с частотой ниже
48,5 Гц – 60 с.

При
выполнении АЧР необходимо учитывать
все реально возможные случаи аварийных
отключений генерирующей мощности и
разделения энергосистемы или
энергообъединения на части, в которых
может возникнуть дефицит активной
мощности. Чем больший дефицит мощности
может возникнуть, тем на большую мощность
должно быть отключено потребителей.
Для того чтобы суммарная мощность
нагрузки потребителей, отключаемых
действием АЧР, хотя бы примерно
соответствовала дефициту активной
мощности, возникшему при данной аварии,
АЧР, как правило, выполняется
многоступенчатой, в несколько очередей,
отключающихся уставками по частоте
срабатывания.

На
рисунке 2.3 приведены кривые, характеризующие
процесс изменения частоты в энергосистеме
при внезапном возникновении дефицита
активной мощности. Если в энергосистеме
отсутствует АЧР, то снижение частоты,
вызванное дефицитом активной мощности,
будет продолжаться до такого установившегося
значения, при котором за счет регулирующего
эффекта нагрузки и действия регуляторов
частоты вращения турбин вновь восстановится
баланс генерируемой и потребляемой
мощности при новом, сниженном значении
частоты (кривая I).

Иначе
будет протекать процесс изменения
частоты при наличии АЧР (кривая II).
Пусть, например, АЧР состоит из трех
очередей с уставками срабатывания 48,
47,5 и 47 Гц. Когда частота снизится до 48
Гц (точка 1), сработают устройства 1-й
очереди и отключают часть потребителей:
дефицит активной мощности уменьшится,
благодаря чему уменьшится и скорость
снижения частоты. При частоте 47,5 Гц
(точка 2) сработают устройства АЧР 2-й
очереди и, отключая дополнительно часть
потребителей, еще дольше уменьшат
дефицит активной мощности и скорость
снижения частоты.

Рисунок
2.3- Изменение частоты при возникновении
дефицита активной мощности: I
– при отсутствии АЧР; II
– при наличии АЧР

При
частоте 47 Гц (точка 3) сработают устройства
АЧР 3-й очереди и отключат потребителей
на мощность, которая достаточна не
только для прекращения снижения частоты,
но и для ее восстановления до номинального
или близкого к номинальному значения.

Устройства
АЧР, используемые для ликвидации
аварийного дефицита мощности в
энергосистемах, подразделяются на три
основные категории.

Первая
категория автоматической частотной
разгрузки — АЧРI
– быстродействующая (t
= 0,1 – 0,3 с.) с уставками срабатывания от
48,5 Гц до 46,5 Гц. Назначение очередей АЧРI
– не допустить глубокого снижения
частоты в первое время развития аварии.
Уставки срабатывания отдельных очередей
АЧРI
отличаются одна от другой на 0,1 Гц.
Мощность, подключаемая к АЧРI,
примерно равномерно распределяется
между очередями.

Вторая
категория автоматической частотной
разгрузки – АЧРII
– предназначена для восстановления
частоты до нормального значения, если
она длительно остается пониженной, или,
как говорят, «зависает» на уровне 48 Гц.
Вторая категория АЧРII
работает после отключения части
потребителей от АЧРI,
когда снижение частоты прекращается и
она устанавливается на уровне около
47,5 – 48,5 Гц.

Верхний
уровень уставок по частоте устройств
АЧРII
принимается в пределах 48,8 – 48,6 Гц на
0,2 Гц выше верхнего уровня уставок по
частоте АЧРI.
При этом диапазон уставок АЧРII
по частоте должен быть 0,3 Гц с интервалом
по очередям 0,1 Гц. Весь объем разгрузки
по АЧРII
разделяется на три –четыре части
(например, 40%, 30% и 30% общего объема).
Уставки по времени АЧРII
устанавливаются возрастающими от АЧРII
с максимальными уставками по частоте
к АЧРII
с минимальными уставками.

Наиболее
ответственных потребителей следует
подключать к к АЧРII
с минимальными уставками по частоте
(максимальными уставками по времени).
Выдержки времени АЧРII
отличаются друг от друга на 3 с и
принимаются равными 5-90 с. Большие
выдержки по времени АЧРII
принимаются для того, чтобы за это время
были мобилизованы резервы активной
мощности, имеющиеся в энергосистеме:
загружены все работающие агрегаты,
пущены и загружены резервные гидроагрегаты.
При этом наибольшие выдержки времени
(70-90с) следует принимать в условиях
возможной мобилизации мощности ГЭС.

В
дефицитных энергосистемах, получающих
мощность от соседних энергосистем,
применяется также быстродействующая
специальная очередь АЧР с уставкой
срабатывания 49 Гц. Эта очередь предназначена
для предотвращения снижения частоты в
ЕЭС до верхних уставок АЧРII
в случаях, когда не удается реализовать
оперативные ограничения потребителей,
а также для разгрузки межсистемных
связей при возникновении дефицита
мощности в энергообъединении. Потребители,
отключенные действием спецочереди
АЧР,должны быть включены в работу не
позже чем через 2 ч после их отключения.

Действие
устройств АЧР должно сочетаться с
другими видами автоматики. Так, например,
для того чтобы АЧР было эффективным,
нагрузка потребителей, отключенных при
аварийном снижении частоты, не должна
подхватываться устройствами АПВ и АВР.
Поэтому АПВ линии, отключенной действием
АЧР, должно блокироваться (не следует
путать с АПВ после АЧР, т.е. с особым
видом автоматики, принципы выполнения
которой рассмотрены ниже). Линии и
трансформаторы, обеспечивающие резервное
питание в схемах АВР, должны отключаться
теми же очередями АЧР, что и основные
питающие линии и трансформаторы.

Автоматическая частотная разгрузка

Содержание

Что такое автоматическая частотная разгрузка и для чего она нужна – Электро Помощь

Автоматическая частотная разгрузка АЧР относится к устройствам релейной защиты и автоматики (РЗиА), предохраняющим систему электроэнергетики от лавинообразного падения и снижения частоты в системе, после появления недостатка мощности активной нагрузки, влекущее за собой отключение потребляющих электроприемников.

По требованию ГОСТа промышленная частота должна составлять 50 Гц с отклонением не более или менее 0,05 Гц.

Ачр — автоматическая частотная разгрузка

Автоматическая частотная разгрузка (АЧР) применяется для сохранения функциональности энергосистемы и потребителей 1-й категории снабжения в ситуациях резкого уменьшения количества активной мощности в электросети.

АЧР относится к противоаварийной автоматике, которая направлена на повышение надёжности работы электросистем

Принцип действия этого метода основан на отключении менее важной части потребителей электроэнергии от сети

Применение АЧР

Понижение частоты может оказывать сильно негативное действие на работоспособность энергетической системы и способно вызвать техногенную или экологическую катастрофу. К примеру, даже небольшое падение частоты на 2-3 герца влечёт за собой снижение поставляемой в конденсатор электростанции воды на 25-40%, может выводить из строя насосы, осуществляющие подачу воды в котлы.

Такой процесс называют лавиной частоты.

Помимо вышеприведенных отрицательных последствий снижения частоты необходимо упомянуть ещё одно — падение напряжения. Этот фактор оказывает дополнительное негативное воздействие на потребителей. Чтобы избежать последствий дефицита активной мощности, приходится в сети отключать часть потребителей

Таким образом, состояние и наличие системы АЧР на подстанциях очень важно

Устройства АЧР классифицируются на категории

  1. ЗАЧР устанавливается для предотвращения возникновения аварии на АЭС. Такие устройства срабатывают при достижении частотой отметки 49,2 Гц. Время срабатывания — 0,5 с.
  2. АЧР-1 срабатывают в случаях резкого падения частоты до отметки 48 Гц. АЧР-1 относится к быстродействующим системам со скоростью срабатывания 0,3-0,5 с.
  3. АЧР-2 начинает работу при продолжительном медленном падении частоты. Она работает на таких же частотах, как и АЧР-1, однако время выдержки устанавливается значительно больше (5-10 или 70-90 секунд).

Действия других систем

АЧР производит лишь экстренное восстановление баланса активной мощности в системе электроснабжения (действуя совместно с АЛАР и делительной защитой), поэтому при большом дефиците активной мощности во время срабатывания АЧР неответственных потребителей происходит автоматическое увеличение вырабатывания электроэнергии на работающих недогруженных блоках электростанций (с помощью направляющих аппаратов турбин на ГЭС, регулирующих клапанов на паропроводах ТЭС и АЭС либо подъёмом замедляющих стержней в реакторах АЭС), нагрузка блоков, работающих на холостом ходу и как крайняя мера-пуск резервных генераторов ГЭС.
По мере поднятия частоты питающей сети необходимо восстанавливать электроснабжение потребителей, отключённых АЧР, что должно происходить постепенно и в строгой последовательности, исходя их текущего значения частоты, времени её нахождения на данном уровне (уставки срабатывания по частоте и по времени) и уровня ответственности данного потребителя, всё это производится другой разновидностью РЗиА — частотным автоматическим повторным включением (ЧАПВ).

Применение

В работе энергосистемы нередко случаются аварии, вызванные разного рода причинами, в результате которых система может потерять часть своих источников питания (аварии на генераторах, питающих трансформаторах). Обычно, в случае потери питания от источника, применяется АВР, с помощью которого к системе подключаются дополнительные источники; или систему соединяют с параллельно работающей системой. Однако во многих случаях мощности источников, питающих параллельную систему, может быть недостаточно для питания своей и добавленной нагрузки, в связи с чем в системе возникает дефицит активной мощности, проявляющийся в первую очередь в снижении частоты системы.

Снижение частоты на десятые доли герца могут привести к ухудшению экономических показателей системы, но серьёзной опасности не несет. (Промышленная частота переменного тока в России и ряде стран Европы принята 50 Гц, В США — 60 Гц) Снижение же частоты на 1-2 Гц и более может привести к серьёзным последствиям для работы энергосистемы, а также для её электроприёмников. Объясняется это тем, что при снижении рабочей частоты снижается скорость вращения питающихся от системы электродвигателей. В число этих двигателей, в частности, входят и механизмы собственных нужд тепловых электростанций, которые также питают данную систему. В результате этого снижается выходная мощность, генерируемая тепловыми электростанциями, и частота падает ещё быстрее. Этот процесс называется «лавиной частоты» и приводит к выводу системы из строя.

Снижение частоты несет разрушительные действия для сложных технологических процессов, может привести к угрозе безопасности людей, повлечь за собой серьёзные техногенные или экологические катастрофы. В частности, при долгой работе крупных паровых турбин на пониженной частоте в них возникают разрушительные процессы, связанные с совпадением частоты вращения турбины с резонансной частотой какой-либо из групп её лопаток.

Кроме частоты, в системе уменьшается напряжение, недостаток которого также серьёзно влияет на состояние потребителей электроэнергии.

Для того, чтобы не допустить обвала частоты в системе, принято отключать часть приёмников электроэнергии, снижая тем самым нагрузку на систему. Подобное отключение называется автоматической частотной разгрузкой (АЧР).

Согласно ПУЭ все потребители электрической энергии делятся на три категории:
I категория — к потребителям этой группы относятся те, нарушение электроснабжения которых может повлечь за собой опасность для жизни людей, значительный материальный ущерб, опасность для безопасности государства, нарушение сложных технологических процессов и пр.
II категория — к этой группе относят электроприёмники, перерыв в питании которых может привести к массовому недоотпуску продукции, простою рабочих, механизмов, промышленного транспорта.
III категория — все остальные потребители электроэнергии.
Потребители I категории должны иметь постоянное электропитание, причем от двух независимых источников. Перерыв в питании от одного из источников допускается только на время действия АВР. Потребители II категории допускают работу от одного источника и перерыв питания не должен превышать время, необходимое для включения резервного источника дежурным персоналом или выездной бригадой. Потребители же III категории допускают перерыв в электропитании до суток (время ликвидации аварии выездной аварийной бригадой). Таким образом, действие АЧР направлено на отключение потребителей III категории, как наименее важных.

При проектировании схемы АЧР электрической системы следует распределять потребителей по подстанциям и распределительным устройствам с учетом этого разделения на категории. Кроме того, следует предусмотреть все возможные виды аварий и предусмотреть такую мощность отключаемых электроприёмников, которой окажется достаточно, чтобы вернуть систему в нормальное состояние после их отключения.
Саму схему АЧР делают многоступенчатой, где каждая ступень отличается от другой уставкой по частоте. То есть, при достижении частоты ниже определённого значения, определяемого первой уставкой, сработает первая ступень и отключит часть потребителей. Затем, если процесс падения частоты не остановился, то при достижении частоты значения второй уставки, отключится следующая группа потребителей, что ещё больше замедлит процесс снижения частоты.

 

 

Помогла ли вам статья?

Задать вопрос

Пишите ваши рекомендации и задавайте вопросы в комментариях

Клиническое применение кластерной АХР для выявления СНМГ

Введение

Миастения гравис (МГ) — относительно редкое, но часто тяжелое нарушение нервно-мышечной передачи, вызывающее значительное утомление 1,2 . MG инициируется иммунными реакциями в нервно-мышечном соединении (NMJ) 3 . У большинства пациентов вырабатываются антитела к ацетилхолиновому рецептору (АХР), представляющему собой пентамер, состоящий из двух субъединиц α и по одной субъединице каждой из остальных: β, δ и ε 4 . Пациенты второго типа вырабатывают антитела к мышечно-специфической тирозинкиназе (MuSK) 5,6 , а пациенты третьего типа вырабатывают антитела к белку-4, родственному рецептору липопротеинов (LRP4), который является мембранным белком NMJ, взаимодействующим с МСК 7 . Доля пациентов с двумя последними типами МГ очень низка, особенно в китайской популяции, и первичный аутоантиген у китайских пациентов с МГ относится к AChR, который сгруппирован и заякорен в постсинаптической мембране NMJ с помощью AChR-ассоциированного антигена. белок синапса (рапсин) 8 .

Rapsyn представляет собой постсинаптический рецепторный белок тирозинкиназы с молекулярной массой 43 кДа, который связан с AChR в NMJ и играет важную роль на ранних стадиях формирования NMJ, индуцированного высвобождаемым нервом агрин 9 . Исследования in vitro показали, что рапсин, экспрессируемый на клеточной поверхности, образует кластеры с субъединицами AChR 10,11 . Основываясь на этих выводах, мы стремились разработать клеточный анализ для диагностики MG.

Пациенты с миастенией без антител к AChR, которые могут быть обнаружены с помощью традиционных методов, называются «серонегативными» пациентами с миастенией (SNMG); у этих людей могут быть антитела против AChR, которые связываются только с кластерами AChR высокой плотности 12 . В частности, эти AChR-отрицательные пациенты, вероятно, генерируют патогенные антитела, которые не связываются эффективно с AChR в растворе, но могут прочно связываться с ex vivo AChR, которые плотно агрегированы на клеточной поверхности 13 . Таким образом, мы предположили, что эти пациенты с SNMG будут иметь низкоаффинные антитела к AChR, которые не могут быть обнаружены с помощью традиционных методов, но могут быть обнаружены путем связывания с AChR на клеточной мембране, особенно если они кластеризуются с высокой плотностью, наблюдаемой при НМЖ. В настоящем исследовании мы проверили эту гипотезу путем экспрессии рекомбинантных субъединиц AChR с кластеризующим белком rapsyn в клетках эмбриональной почки человека (HEK) и исследовали связывание антител методом иммунофлуоресценции (как показано на диаграмме, рис. 1a).

Рисунок 1

Трансфекция субъединиц AChR и конфокальные изображения сывороток пациентов с SNMG.

( a ) Схема, иллюстрирующая принцип клеточного обнаружения. ( b ) Трансфецированные гены были проверены вестерн-блоттингом, на рисунке использованы обрезанные блоты, а полный рисунок доступен в дополнительной информации. Клетки HEK293T были разделены на четыре группы: трансфицированные пустыми векторами в качестве отрицательного контроля; трансфицированы векторами, кодирующими только GFP-RAPSYN; трансфицированы четырьмя субъединицами AChR без GFP-RAPSYN; и трансфицировали всеми пятью векторами (четыре субъединицы AChR с GFP-RAPSYN). Экспрессия субъединиц AChR показана в b1 и b2, а экспрессия GFP показана в b3. ( c , d ) Образцы сыворотки пациента с SNMG (c; положительный контроль) и здорового субъекта (d; отрицательный контроль) исследовали с помощью клеточного анализа. Иммунофлуоресцентная совместная локализация GFP и антител против AChR (красный) наблюдалась только в сыворотке пациентов с SNMG, но не у здоровых субъектов. Увеличение: ×400. Клетки с двойным окрашиванием подсчитывали с помощью FACS для статистического анализа, показанного на следующем рисунке.

Изображение в полный размер

В это исследование с января 2013 г. по апрель 2014 г. были включены 52 пациента с миастенией, в том числе 24 пациента с диагнозом SNMG, у которых на основании традиционных методов был отрицательный результат по MuSK. Сыворотку этих пациентов дополнительно исследовали на наличие антител против AChR с использованием нашего нового клеточного анализа.

Материалы и методы

Скрининг больных СНМГ методом ИФА

Нами была взята сыворотка крови 52 пациентов, которым по клиническим и электромиографическим критериям был поставлен диагноз МГ. Мы повторно проанализировали все образцы на антитела против AChR и MuSK с помощью ELISA (R&D, Inc., Миннеаполис, Миннесота, США) в соответствии с протоколом производителя. Мы провели наше исследование в соответствии с соответствующими руководящими принципами и законами в Шанхае: все экспериментальные протоколы были одобрены больницей Чанхай, а одобрение комитета по этике, подготовленное региональным правительством, было отменено для образцов крови, поскольку они не были получены специально для исследовательских целей. Все пациенты подписали форму информированного согласия. С помощью ELISA двадцать восемь пациентов были положительными на антитела к AChR (AChR-MG), а 24 пациента были определены как имеющие SNMG на основании результатов, полученных для здоровых людей в нашей лаборатории с использованием того же набора ELISA. Эти образцы сыворотки, а также образцы сыворотки здоровых субъектов, использованные в качестве отрицательного контроля, впоследствии исследовали с помощью клеточных анализов.

Конструирование и трансфекция субъединиц AChR

Мы трансфицировали клетки HEK 293 (предоставленные Базовой медицинской школой Лаборатории биохимии и молекулярной биологии Университета Фудань) плазмидами, содержащими каждую из субъединиц AChR α, β, δ и ε вместе с рапсином -EGFP, как описано ранее 12 . Плазмиды, содержащие нашу целевую кДНК, были щедро предоставлены биохимическим Шанхайским университетом Фудань. Мы создали четыре группы трансфицированных клеток: 1) клетки, трансфицированные пустыми векторами в качестве отрицательного контроля; 2) клетки, трансфицированные только GFP-RAPSYN; 3) клетки, трансфицированные четырьмя субъединицами АХР без GFP-RAPSYN; и 4) клетки, трансфицированные всеми четырьмя субъединицами AChR и GFP-RAPSYN. Успешную конструкцию и экспрессию трансфицированных молекул подтверждали вестерн-блоттингом.

Анализы на основе клеток

Описанные выше трансфицированные клетки HEK293 высевали в 24-луночные планшеты для культивирования клеток и на дно каждой лунки помещали покровное стекло. Через 24 часа, чтобы обеспечить прилипание клеток к покровным стеклам, клетки фиксировали 4% параформальдегидом. Затем в лунку добавляли 15 мкл сыворотки от каждого пациента, чтобы получить первичное антитело, и оставляли реакцию на 1 час при комнатной температуре. После 3-кратного промывания лунок PBS добавляли вторичное антитело (красное) на 45 минут при комнатной температуре. Клетки, которые реагировали с сывороточным AChR (красный) и GFP, выявляли с помощью конфокальной микроскопии.

Анализ FACS

Для анализа методом проточной цитометрии 1 × 10 6 клеток/лунку культивировали в 6-луночных культуральных планшетах и ​​трансфицировали, как описано выше. Приблизительно через 48 часов клетки отделяли от планшета с помощью трипсина/ЭДТА, центрифугировали, подсчитывали и ресуспендировали в холодном PBS в концентрации 10 х клеток/мл. После промывки клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера для связывания и центрифугировали, а осадок инкубировали в 300 мкл 1% BSA (разбавленного в PBS) плюс 15 мкл сыворотки в течение 1 часа. После трех промывок клетки ресуспендировали в 300 мкл Су3-конъюгированного ослиного античеловеческого IgG (Proteintech Group, США) в качестве вторичного антитела в разведении 1:500 в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте для обнаружения связанного антитела. . После обширной промывки клетки сразу же анализировали с использованием системы FACSCalibur (BD Pharmingen, Сан-Хосе, Калифорния, США). Данные были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения CellQuest. Клетки, окрашенные сывороткой здоровых субъектов, были обозначены как отрицательный контроль, тогда как клетки, окрашенные сывороткой пациентов с высоким титром AChR (обнаруженных с помощью набора ELISA), использовались в качестве положительного контроля.

Результаты

Обнаружение на основе клеток антител к кластерным AChR в сыворотке SNMG с помощью конфокальной визуализации

Мы трансфицировали клетки HEK293T плазмидами, кодирующими различные субъединицы AChR и rapsyn-GFP. Эффективность трансфекции для субъединиц AChR была подтверждена вестерн-блоттингом, который показал четкие полосы, соответствующие этим субъединицам, тогда как в контрольных клетках HEK293T, трансфицированных пустыми векторами, или в клетках, трансфицированных только rapsyn-GFP, полос не наблюдалось. Кроме того, экспрессия GFP была обнаружена только в клетках, трансфицированных rapsyn-GFP или AChR-rapsyn-GFP (рис. 1б). Скорость трансфекции была дополнительно подтверждена проточной цитометрией, которая показала> 70% клеток GFP+ среди клеток, трансфицированных GFP. Эти результаты подтвердили, что HEK29Клетки 3T были успешно трансфицированы нашими целевыми генами.

Затем мы провели ИФА для обнаружения аутоантител в сыворотке пациентов с миастенией. Среди 52 зарегистрированных пациентов 24 были классифицированы как имеющие СНМГ. Таким образом, мы затем проверили сывороточные антитела против AChR у этих пациентов, используя иммуноокрашивание трансфицированных клеток HEK293T и конфокальную микроскопию. Как показано на рис. 1d, трансфицированные клетки, добавленные к сыворотке пациентов с SNMG, демонстрировали как экспрессию GFP, так и антитела против AChR (красные), которые были связаны с AChR, сгруппированными на поверхности HEK29.3Т клетки. Напротив, клетки, добавленные к сыворотке здоровых людей (отрицательный контроль), показали только экспрессию GFP и отсутствие антител против AChR. Чтобы избежать неточных результатов, мы не подсчитывали двойное окрашивание на предметных стеклах невооруженным глазом, а вместо этого проводили статистический анализ положительных клеток с помощью проточной цитометрии (см. ниже). Тем не менее, результаты конфокальной микроскопии предоставили убедительные доказательства возможности этого клеточного обнаружения антител против AChR у пациентов с SNMG.

Проточная цитометрия

Затем мы провели проточную цитометрию для подтверждения результатов иммуноокрашивания трансфицированных клеток после инкубации с различными группами сывороток. Среди всех закрытых живых клеток (рис. 2а) зеленая флуоресценция представляла клетки, трансфицированные GFP-rapsyn, которые показали эффективность трансфекции> 70% (рис. 2b-d; закрытые клетки в правой части диаграммы рассеяния). . Пороговое значение для положительных клеток определяли как среднее +3 стандартных отклонения (SD) (0,9).8%) результатов для 12 здоровых контролей (статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения SPSS, версия 18.0), а клетки в верхней правой области (двойной положительный результат) представляли собой трансфицированные клетки, связанные с сывороточными антителами против AChR. Как показано на рис. 2б, было очень мало АХР-положительных клеток среди трансфицированных клеток, инкубированных с сывороткой здоровых людей (отрицательный контроль), тогда как сыворотка от пациентов с АХР-МГ (положительный контроль) содержала АХР-положительные клетки (рис. 2в). ). Важно отметить, что 11 из 24 случаев SNMG (45,83%) были положительными по AChR-Ab с использованием этого метода (рис. 2d). Выявлена ​​значительная разница в связывании IgG между сыворотками пациентов с СНМГ и АХР-МГ и сыворотками здоровых людей (P < 0,05–0,001; рис. 2д).

Рисунок 2

FACS-анализ.

Сыворотки из разных групп инкубировали с трансфицированными клетками HEK293T и анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки, отмеченные в верхней правой (UR) части графика рассеяния, представляют собой клетки с двойным окрашиванием, которые считались положительными в отношении AChR-антител. Порог был определен как среднее +3 SD (= 0,98%) результатов связывания 12 здоровых контролей с кластерным AChR. ( a ) Демонстрация литников. ( b ) Графики рассеяния из анализа FACS отрицательного контроля (здоровый субъект). ( c ) Диаграммы рассеяния образца от пациента с миастенией, чья сыворотка была анти-AChR-положительной на основании ELISA (AChR-MG), служащего положительным контролем. ( d ) Образец сыворотки пациента с SNMG. ( e ) Резюме результатов анализа FACS трех групп. n = 12 у здоровых добровольцев (отрицательный контроль), n = 24 у пациентов с СНМГ и n = 6 у пациентов с АХР-МГ (положительный контроль).

Изображение в натуральную величину

Клинические описания 11 случаев SNMG

Пациенты без антител к AChR или MuSK относились к пациентам с SNMG. Мы ретроспективно изучили данные 24 пациентов с СНМГ, которым на основании как основных, так и дополнительных критериев был поставлен диагноз МГ в Первом филиале Второго военно-медицинского университета. Было обнаружено, что пациенты с антителами к кластерным AChR составляют 45,83% (11 из 24) наших пациентов с SNMG, и клинические характеристики этих пациентов были проанализированы дополнительно (таблица 1). Среди этих больных было 7 мужчин и 4 женщины, возраст дебюта заболевания от 19 лет.до 63 лет (в среднем 41 год). Слабость глаз была наиболее частым симптомом миастении, и часто наблюдалась бульбарная слабость с безболезненной дисфагией, дизартрией или затрудненным жеванием. Больные находились на разных стадиях течения заболевания с максимальной степенью тяжести от II до III по классификации Оссермана 14 . Пациенты 4, 6 и 10 находились на пике тяжести заболевания, тогда как состояние пациентов 1, 5 и 9 уже значительно улучшилось после лечения. У пяти пациентов было раннее начало миастении (до 40 лет), и у пяти была тимэктомия. Эти пациенты с SNMG имели те же клинические проявления, что и пациенты с AChR-позитивными антителами к MG.

Таблица 1

Полноразмерная таблица

Обсуждение

Настоящее исследование доказало, что новый клеточный анализ может повысить частоту выявления AChR-антител-положительных пациентов с MG, особенно пациентов с SNMG. Предыдущие исследования показали, что SNMG был подобен AChR-MG с точки зрения патофизиологии заболевания, симптомов, связанных со слабостью, и распределения ответа на лечение 12 . Поэтому мы предположили, что антитела против AChR вырабатывались у некоторых пациентов с SNMG, но не могли быть идентифицированы обычными анализами. Существует несколько возможных объяснений невозможности обнаружения антител к АХР у пациентов с СНМГ. Хотя могут существовать антитела к другому белку NMJ, наиболее правдоподобным объяснением является неспособность современных методов обнаружить антитела, учитывая большее сходство клинических признаков пациентов с SNMG и AChR-MG. В частности, антигенные детерминанты могут отсутствовать в солюбилизированном AChR, используемом в традиционном анализе, или неудача может произойти из-за низкой аффинности антител AChR к растворимым AChR. Без кластеризации метаболическая стабильность AChR снижается, что приводит к ложноотрицательным результатам 15 . Наши результаты убедительно продемонстрировали наличие иммунного ответа на AChR, когда антитела кластеризовались с рапсином у некоторых пациентов, у которых сывороточные антитела не обнаруживались с помощью рутинных анализов иммунопреципитации. Еще одна трудность в диагностике была связана с тем, что некоторые пациенты уже получали иммуносупрессивную терапию, а некоторым из них даже была проведена тимэктомия перед взятием проб. Эти вмешательства могли повлиять на эффективность обнаружения различных антител.

Рапсин имел большое значение для построения кластерной модели АЧР 16 . Действительно, наше исследование показало, что, когда рапсин-кластерный AChR экспрессировался в своей нативной конформации с плотностью, аналогичной плотности в NMJ, антитела к AChR могли быть обнаружены в 45,83% (11/24) образцов сыворотки, которые ранее были отрицательными для связывания. к АЧР в растворе. Положительные клетки были подтверждены анализом FACS как клетки с двойным окрашиванием, и мы посчитали некоторые из них отрицательными результатами, когда они не достигли установленного нами стандарта, 0,9.8%, который был получен из сывороток 12 здоровых лиц (данные представлены на рис. 2б–д). Учитывая неточность и сложность подсчета клеток с двойным окрашиванием невооруженным глазом с помощью микроскопа, мы использовали анализ FACS для подсчета этих клеток и считаем этот метод объективным, точным и достаточно мощным, чтобы заменить трудоемкий и субъективный ручной подсчет. .

Наши результаты имеют важное клиническое и техническое значение, поскольку в конечном итоге они могут стать основой для нового анализа для обнаружения AChR и других антител в MG, а подходы, подобные тем, которые мы использовали, могут стать частью рутинной практики для диагностики растущего число аутоантител-опосредованных заболеваний периферической и центральной нервной систем. Хотя существуют и другие типы доступных анализов, клеточные анализы обладают определенными преимуществами. Например, антиген экспрессируется на поверхности HET29.3 клетки и только внеклеточные эпитопы будут обнаружены, если клетки живы и непроницаемы. Напротив, белки, используемые в других анализах, таких как ELISA, обычно являются рекомбинантными и продуцируются в бактериальных системах экспрессии с возможностью неправильной укладки. Кроме того, часто выявляются антитела к внутриклеточным эпитопам, которые вряд ли могут быть патогенными. Еще одним преимуществом клеточных анализов является то, что высокие уровни экспрессии могут быть гарантированы на клеточной поверхности за счет временной трансфекции кластерного белка, что повышает чувствительность связывания. Напротив, индуцированная рапсином кластеризация не может быть достигнута в процессе покрытия искусственным антигеном 17 . В экспериментах на животных патогенность анти-AChR-антител может быть определена по экспрессии rapsyn, тогда как декластеризация AChR может быть связана со сниженным связыванием антител 18 . Эти результаты повысили вероятность того, что изменения в геометрии упаковки кластеров или внутриклеточные модификации AChR могут влиять на связывание низкоаффинных антител 19 .

Таким образом, наши результаты показали, что антитела к AChR могут быть обнаружены примерно у половины так называемых пациентов с SNMG с помощью нашего клеточного анализа. Этот метод представляет собой более чувствительный подход, чем классический ИФА, что увеличивает частоту диагностики и снижает частоту SNMG 9.0005 20 . Это исследование было первым случаем, когда обнаружение MG на основе клеток было применено в китайской популяции. Кроме того, этот подход позволил избежать травм медицинского персонала из-за радиоактивных материалов. Таким образом, используя простую и точную проточную цитометрию, клеточные анализы могут быть включены в рутинную диагностику и лечение для повышения чувствительности и специфичности (как показано в нашем исследовании) обнаружения аутоантител при SNMG.

Дополнительная информация

Как цитировать эту статью : Чжао, Г. и др. . Клиническое применение кластерной АХР для выявления SNMG. Науч. 5 , 10193; doi: 10.1038/srep10193 (2015).

Ссылки

  • Lee, S.J. et al. Миастения Гравис, проявляющаяся первоначально как острая дыхательная недостаточность. Респираторная помощь, 10.4187/respcare.03210 (2014).

  • Aragones, J.M. et al. Миастения гравис: болезнь очень старых. Журнал Американского гериатрического общества 62, 196–197 (2014).

    Артикул

    Google ученый

  • Акаиши Т. и др. Взгляд на классификацию миастении. PloS one 9, e106757, 10.1371/journal.pone.0106757 (2014).

    Артикул
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    КАС
    пабмед
    ПабМед Центральный

    Google ученый

  • Koneczny, I., Cossins, J., Waters, P., Beeson, D. & Vincent, A. MuSK myasthenia gravis IgG4 нарушает взаимодействие LRP4 с MuSK, но и IgG4, и IgG1-3 могут рассеивать предварительно сформированный агрин -независимые кластеры АХР. PloS один 8, e80695, 10.1371/journal.pone.0080695 (2013).

    Артикул
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    КАС
    пабмед
    ПабМед Центральный

    Google ученый

  • Hoch, W. et al. Аутоантитела к рецепторной тирозинкиназе MuSK у больных миастенией без антител к ацетилхолиновым рецепторам. Природная медицина 7, 365–368, 10.1038/85520 (2001).

    Артикул
    КАС
    пабмед

    Google ученый

  • Джордж С. и др. Стабильная экспрессия киназы, специфичной для мышц человека, в клетках HEp-2 M4 для автоматической иммунофлуоресцентной диагностики миастении. PloS one 9, e83924, 10.1371/journal.pone.0083924 (2014).

    Артикул
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    КАС
    пабмед
    ПабМед Центральный

    Google ученый

  • Cossins, J. et al. Поиск новых антигенных мишеней при миастении. Анналы Нью-Йоркской академии наук 1275, 123–128, 10.1111/j.1749-6632.2012. 06833.х (2012).

    Артикул
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    КАС
    пабмед

    Google ученый

  • Yeh, JH, Chen, WH, Chiu, HC & Vincent, A. Низкая частота антител MuSK при генерализованной серонегативной миастении среди китайцев. Неврология 62, 2131–2132 (2004).

    Артикул

    Google ученый

  • d’Houtaud, S. et al. [Формирование и регенерация синапсов]. Нейрохирургия 55 Приложение 1 S49–62, 10.1016/j.neuchi.2008.03.014 (2009).

    Артикул
    пабмед

    Google ученый

  • Санес, Дж. Р. и Лихтман, Дж. В. Индукция, сборка, созревание и поддержание постсинаптического аппарата. Обзоры природы. Неврология 2, 791–805, 10.1038/35097557 (2001).

    Артикул
    КАС
    пабмед

    Google ученый

  • Мартинес-Мартинес, П. и др. Сверхэкспрессия рапсина в мышцах крыс увеличивает уровни ацетилхолиновых рецепторов при хронической экспериментальной аутоиммунной миастении. Американский журнал патологии 170, 644–657, 10.2353/ajpath.2007.060676 (2007).

    Артикул
    КАС
    пабмед
    ПабМед Центральный

    Google ученый

  • Лейте М.И. и др. Антитела IgG1 к ацетилхолиновым рецепторам при «серонегативной» миастении. Мозг: журнал неврологии 131, 1940–1952, 10.1093/brain/awn092 (2008).

    Артикул

    Google ученый

  • Винсент А. и др. Антитела, идентифицированные с помощью клеточных анализов при миастении и связанных с ней заболеваниях. Анналы Нью-Йоркской академии наук 1274, 92–98, 10.1111/j.1749-6632.2012.06789.x (2012).

    Артикул
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    КАС
    пабмед

    Google ученый

  • Osserman, K.E. & Genkins, G. Исследования миастении гравис: обзор двадцатилетнего опыта более чем 1200 пациентов. Медицинский журнал Mount Sinai, Нью-Йорк, 38, 497–537 (1971).

    КАС
    пабмед

    Google ученый

  • Фамбро Д. М. Контроль рецепторов ацетилхолина в скелетных мышцах. Физиологические обзоры 59, 165–227 (1979).

    Артикул
    КАС

    Google ученый

  • Чанг, Т. и др. Клиническое и серологическое исследование миастении с использованием как радиоиммунопреципитации, так и клеточных анализов у ​​населения Южной Азии. Журнал неврологических наук 343, 82–87, 10.1016/j.jns.2014.05.037 (2014).

    Артикул
    пабмед

    Google ученый

  • Девич, П. и др. Антитела к кластерному ацетилхолиновому рецептору: расширение фенотипа. Европейский журнал неврологии: официальный журнал Европейской федерации неврологических обществ 21, 130–134, 10.1111/en.12270 (2014).

    Артикул
    КАС

    Google ученый

  • Зубер, Б. и Анвин, Н. Структура и суперорганизация комплексов ацетилхолиновый рецептор-рапсин. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 110, 10622–10627, 10. 1073/pnas.1301277110 (2013).

    Артикул
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    пабмед
    ПабМед Центральный

    Google ученый

  • Лозен, М. и др. Повышенная экспрессия рапсина в мышцах предотвращает потерю ацетилхолиновых рецепторов при экспериментальной аутоиммунной миастении. Мозг: журнал неврологии 128, 2327–2337, 10.109.3/мозг/awh612 (2005).

    Артикул

    Google ученый

  • Зувелу, В. и др. АХР-миастения, переходящая в двойную серопозитивную через несколько лет после начала заболевания. Журнал нейроиммунологии 267, 111–112, 10.1016/j.jneuroim.2013.12.012 (2014).

    Артикул
    КАС
    пабмед

    Google ученый

Ссылки на скачивание

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81230027, 81070959) и Ключевым научно-техническим проектом Шанхая (11411950300). Благодарим пациентов за участие. Мы также благодарим г-жу Кэтрин Риган за ее прекрасную редакторскую помощь.

Информация об авторе

Примечания автора

  1. Чжао Гуан, Ван Сяоцин и Юй Сяовэнь внесли равный вклад в эту работу.

Авторы и филиалы

  1. Кафедра неврологии, Чанхайский госпиталь, Второй военно-медицинский университет, Шанхай, Китай

    Гуан Чжао, Сяоцин Ван, Сяовэнь Юй, Сютянь Чжан и Цзяньмин Цзян

  2. Кафедра неврологии, Больница Цзяньцзун, Шанхай Шанхай, Китай

    Xiaoqing Wang & Yangtai Guan

Авторы

  1. Guang Zhao

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в
    PubMed Google Академия

  2. Xiaoqing Wang

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в
    PubMed Google Scholar

  3. Xiaowen Yu

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в
    PubMed Google Scholar

  4. Xiutian Zhang

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в
    PubMed Google Scholar

  5. Yangtai Guan

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в
    PubMed Google Scholar

  6. Jianming Jiang

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в
    PubMed Google Scholar

Contributions

G. Z. и X.Q.W. провел эксперименты; XWY написал рукопись; Х.Т.З. и X.W.Y. собрал клинические данные; JMJ разработал схемы экспериментов; YTG руководил экспериментом. Все авторы внесли свой вклад в обсуждение схемы эксперимента и теоретического протокола.

Заявление об этике

Конкурирующие интересы

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

Электронные дополнительные материалы

Дополнительная информация

Права и разрешения

Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons на статью, если иное не указано в кредитной строке; если материал не включен в лицензию Creative Commons, пользователям необходимо будет получить разрешение от держателя лицензии на воспроизведение материала. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Перепечатки и разрешения

Об этой статье

Синаптическая передача в скелетном нервно-мышечном соединении (Раздел 1, Глава 4) Неврология в Интернете: Электронный учебник по нейронаукам | Кафедра нейробиологии и анатомии

Синапс — это специализированная структура, позволяющая одному нейрону взаимодействовать с другим нейроном или мышечной клеткой. В мозгу миллиарды нервных клеток, и каждая нервная клетка может создавать и получать до 10 000 синаптических соединений с другими нервными клетками. Кроме того, сила синапса поддается изменению. Изменения силы синапсов наделяют нервную систему способностью хранить информацию.

Наиболее известен синапс, образованный между спинальным двигательным нейроном и клеткой скелетной мышцы. Исторически он широко изучался, потому что его относительно легко анализировать. Однако основные свойства синаптической передачи в скелетном нервно-мышечном соединении очень сходны с процессом синаптической передачи в центральной нервной системе.

Рисунок 4.1 (см. увеличенный вид)

Следовательно, понимание этого синапса ведет к пониманию других. Поэтому сначала мы обсудим процесс синаптической передачи в скелетном нервно-мышечном соединении.

Особенности синаптического соединения нервно-мышечного соединения показаны на рисунке слева. Скелетные мышечные волокна иннервируются мотонейронами, тела которых расположены в вентральных рогах спинного мозга. Конечная область аксона дает начало очень тонким отросткам, которые проходят вдоль клеток скелетных мышц. Вдоль этих процессов расположены специализированные структуры, известные как синапсы. Конкретный синапс, образующийся между спинальным мотонейроном и клеткой скелетных мышц, называется моторной концевой пластинкой из-за его специфической структуры.

Синапс нервно-мышечного синапса имеет три характерные особенности химических синапсов в нервной системе. Во-первых, существует четкое разделение между пресинаптической и постсинаптической мембранами. Пространство между ними известно как синаптическая щель . Пространство говорит нам, что между пресинаптическим нейроном и постсинаптическим нейроном должен существовать какой-то промежуточный сигнальный механизм, чтобы поток информации проходил через синаптическую щель. Во-вторых, характерна высокая плотность мелких сферических везикул. Эти синаптические пузырьки содержат нейротрансмиттерные вещества. Синапсы также связаны с высокой плотностью митохондрий. В-третьих, в большинстве случаев имеется характерное утолщение постсинаптической мембраны, что обусловлено, по крайней мере отчасти, тем, что постсинаптическая мембрана имеет высокую плотность специализированных рецепторов, связывающих химические медиаторные вещества, высвобождаемые из пресинаптического нейрона. Дополнительные сведения о морфологических особенностях синаптических соединений приведены в главах 8 и 10.

4.2 Физиология синаптической передачи в нервно-мышечном соединении

Рисунок 4.2

На рисунке справа очень схематично показано, как можно детально изучить физиологию синаптической передачи в скелетных нервно-мышечных соединениях. Кусок мышцы и прикрепленный к нему нерв помещают в небольшую экспериментальную камеру, заполненную соответствующим раствором Рингера. Потенциал покоя мышечной клетки регистрируют микроэлектродом. Электроды также размещаются на поверхности аксона нерва. Кратковременные удары электрическим током вызывают инициацию потенциалов действия, которые распространяются на синаптическое окончание.

На рисунке ниже показаны два типа потенциальных изменений, которые были зарегистрированы в таком изолированном препарате нервно-мышечной ткани. Эксперимент также иллюстрирует свойства мощного препарата кураре , который оказался очень полезным при изучении процесса синаптической передачи в скелетных нервно-мышечных соединениях. Часть А иллюстрирует последовательность потенциальных изменений, зарегистрированных в мышечной клетке в результате стимуляции моторного аксона. Стрелка указывает момент времени, когда разряд доставляется к двигательному аксону. Обратите внимание, что после шока наступает период покоя. Задержка связана со временем, которое требуется потенциалу действия в моторном аксоне для распространения от места его инициации. После задержки в мышечной клетке регистрируются потенциалы двух типов. Во-первых, существует относительно медленно меняющийся потенциал, который будет в центре внимания следующего обсуждения. Если этот медленный начальный потенциал достаточно велик, как это обычно бывает в клетках скелетных мышц, в мышечной клетке возникает второй потенциал, потенциал действия.

Рисунок 4.3

Потенциалы действия в клетках скелетных мышц обусловлены ионными механизмами, подобными рассмотренным ранее. В частности, существует зависящее от напряжения изменение проницаемости Na + , за которым следует замедленное увеличение проницаемости K + . (Однако для клеток гладкой мускулатуры и клеток сердечной мышцы ионные механизмы различны.)

Основное событие, запускающее потенциал действия, можно выявить, воспользовавшись curare , ядом для стрел, используемым некоторыми южноамериканскими индейцами. Низкая доза кураре (Часть B) уменьшает основное событие, но все еще недостаточно, чтобы упасть ниже порогового значения. Если вводится несколько более высокая доза кураре (часть C), медленное основное событие становится подпороговым. Основной сигнал известен как потенциал замыкательной пластинки (EPP), потому что это изменение потенциала, зарегистрированное на замыкательной пластинке двигателя. Как правило, он известен как возбуждающий постсинаптический потенциал (ВПСП) .

Кураре блокирует потенциал замыкательной пластинки, поскольку является конкурентным ингибитором ацетилхолина (АХ), медиатора, высвобождаемого в пресинаптических окончаниях. Кураре не блокирует потенциалзависимую проводимость Na + или потенциалзависимую проводимость K + , лежащую в основе потенциала действия мышц. Кураре воздействует на стимул (ВПСП), что обычно приводит к инициации потенциала действия мышц. Животное, отравленное кураре, задохнется, потому что блокируется процесс нервно-мышечной передачи в дыхательных мышцах.

В норме величина потенциала замыкательной пластинки довольно велика. Действительно, амплитуда потенциала замыкательной пластинки составляет около 50 мВ, но для достижения порога необходимо всего около 30 мВ. Дополнительные 20 мВ называются коэффициентом безопасности . Следовательно, даже если потенциал концевой пластинки станет несколько меньше (например, 40 мВ по амплитуде) из-за утомления, ПКП достигнет порогового значения, и соотношение один к одному между потенциалом действия в двигательном аксоне и потенциалом действия в мышечная клетка будет сохранена.

Рисунок 4.4

4.3 Распространение ПКП

Каковы свойства ПКП и как они соотносятся со свойствами потенциала действия?

Является ли потенциал концевой пластинки следствием зависящего от напряжения изменения проницаемости Na + и K + подобно потенциалу действия?

Распространяется ли потенциал концевой пластинки по принципу «все или ничего», как потенциал действия?

На рисунке слева показан эксперимент по изучению распространения потенциала концевой пластинки. Мышечное волокно многократно прокалывают электродами с интервалом 1 мм. (Обратите внимание, что потенциал концевой пластинки мал, потому что этот эксперимент проводится в присутствии низкой концентрации кураре, поэтому потенциал замыкательной пластинки может быть зарегистрирован без осложнений, связанных с запуском потенциала действия.) Потенциал замыкательной пластинки не распространяется в режиме «все или -ничего модного. Он распространяется вдоль мышцы, но с уменьшением. Таким образом, распространение потенциала замыкательной пластинки от места его инициации к другим участкам вдоль мышечной клетки происходит пассивно и с уменьшением, точно так же, как подпороговое изменение потенциала в одном участке аксона распространяется вдоль аксона, или так же, как изменение температуры в одной точке на металлическом стержне распространяется вдоль стержня.

4.4 Обзор последовательности событий, лежащих в основе ПОП

Рисунок 4. 5

Каковы другие этапы процесса химической синаптической передачи? На рис. 4.5 представлен обзор. Потенциал действия нерва, который инициируется в теле клетки спинального мотонейрона, распространяется от вентральных корешков и в конечном итоге проникает в синаптические окончания мотонейронов. В результате потенциала действия химический медиатор ацетилхолин (АХ) высвобождается в синаптическую щель. АХ диффундирует через синаптическую щель и связывается со специальными рецепторами на постсинаптической или постсинаптической мембране. Связывание АХ с его рецепторами вызывает конформационные изменения в мембранном канале, который специфически проницаем как для Na + и К +. В результате увеличения проницаемости Na + и K + происходит деполяризация постсинаптической мембраны. Эта деполяризация называется потенциалом замыкательной пластинки или, в более общем смысле, ВПСП. Если ВПСП достаточно велик, как это обычно бывает в нервно-мышечном соединении, это приводит к инициации потенциала действия в мышечной клетке. Потенциал действия инициирует процесс сопряжения возбуждения с сокращением и развития напряжения. Длительность потенциала замыкательной пластинки составляет около 10 мсек.

Два фактора контролируют продолжительность ВПСП в нервно-мышечном синапсе. Первый , АХ удаляется путем диффузии. Второй , вещество в синаптической щели, называемое ацетилхолинэстеразой (АХЭ) , гидролизует или расщепляет АХ. АХЭ является одним из наиболее эффективных известных ферментов. Одна молекула АХЭ может гидролизовать 600 000 молекул АХ в минуту.

4.5 Роль АХЭ

Рисунок 4.6

Важное семейство веществ, одним из которых является неостигмин, ингибирует действие АХЭ. Неостигмин блокирует действие АХЭ и, таким образом, делает потенциал замыкательной пластинки больше и дольше по продолжительности. На этом рисунке показаны два потенциала замыкательной пластинки. Один был зарегистрирован в физиологическом растворе и кураре, а второй — после добавления к раствору неостигмина. (Кураре добавляется, чтобы можно было изучить свойства ПКП, не вызывая потенциала действия в мышечной клетке.) После применения неостигмина потенциал концевой пластинки намного больше и дольше по продолжительности.

 

 

4.6a Миастения

Миастения гравис связана с тяжелой мышечной слабостью из-за уменьшения количества ацетилхолиновых рецепторов в мышечной клетке. Если потенциал замыкательной пластинки меньше, потенциал замыкательной пластинки не достигнет порогового значения. Если он не достигает порога, в мышечной клетке не будет потенциала действия и сокращения мышцы, что вызывает мышечную слабость. Неостигмин и другие ингибиторы АХЭ используются для лечения больных миастенией. Эти агенты позволяют количеству высвобождаемого ацетилхолина более эффективно достигать оставшихся ацетилхолиновых рецепторов.

4.6b Нервно-паралитические агенты

Хотя ингибиторы АХЭ имеют важное терапевтическое значение, некоторые ингибиторы использовались и до сих пор используются в качестве ядов. Некоторые ингибиторы АХЭ, такие как зоман и зарин, образуют довольно необратимый блок АХЭ. Этот блок приводит к экстремальным уровням АХ в синаптической щели. Люди, отравленные таким образом, умирают от судорог и спастичности мышц, включая дыхательные мышцы.

Рисунок 4.7

4.7 Ионофорез АХ

Ионофорез представляет собой интересный метод, который можно использовать для дальнейшей проверки гипотезы о том, что АХ является нейротрансмиттерным веществом в нервно-мышечном синапсе. Если АХ является передатчиком, который высвобождается этим синапсом, можно было бы предсказать, что должно быть возможно заменить искусственное применение передатчика на нормальное высвобождение передатчика. Поскольку АХ является положительно заряженной молекулой, ее можно вытеснить из микроэлектрода, чтобы имитировать высвобождение АХ из пресинаптического терминала.

Рисунок 4.8

Действительно, небольшое количество АХ можно наносить вблизи нервно-мышечного синапса. На рис. 4.8 сравниваются ПКП, вызванные стимуляцией моторного аксона, и реакция на выбросы АХ. Изменение потенциала выглядит почти идентично потенциалу замыкательной пластинки, вызванному нормальным выбросом АХ. Этот эксперимент обеспечивает экспериментальную поддержку концепции, согласно которой АХ является естественным передатчиком в этом синапсе.

Реакция на выброс АХ имеет некоторые другие интересные свойства, которые все согласуются с холинергической природой синапсов в скелетных нервно-мышечных соединениях. Неостигмин удлиняет и увеличивает ответ на ионтофорез АХ. Кураре снижает ответ, потому что он конкурирует с нормальным связыванием ацетилхолина. Если АХ выбрасывается в мышечную клетку, ничего не происходит, потому что рецепторы ацетилхолина находятся не внутри; они находятся снаружи мышечной клетки. Применение ацетилхолина к областям мышцы, удаленным от концевой пластинки, не вызывает ответа, поскольку рецепторы АХ сосредоточены в синаптической области.

Чтобы проверить свое понимание, подумайте, как такой агент, как ТТХ, повлияет на генерацию как ПКП, так и на реакцию мышечного волокна на ионофоретическое применение АХ? TTX не влияет на реакцию на ACh, но блокирует EPP. Причина, по которой реакция на АХ остается неизменной, ясна, но многие ожидают, что если здесь нет эффекта, то не должно быть никакого эффекта и на ПОП. Тетродотоксин не влияет на связывание ацетилхолина с рецепторами и, следовательно, не влияет на ответ на прямое применение АХ. Однако тетродотоксин будет влиять на способность потенциала действия вызываться в двигательном аксоне. Если потенциал действия не может быть вызван в двигательном аксоне, он не может вызвать высвобождение медиатора. Таким образом, тетродотоксин полностью отменил бы ЭПП. Блокировка не должна быть связана с блокировкой рецепторов АХ, а скорее с блоком на каком-то этапе до высвобождения медиатора.

4.8 Ионные механизмы ПКП

Бернард Кац и его коллеги были пионерами в изучении механизмов синаптической передачи в нервно-мышечном соединении. Они предположили, что канал, открытый АХ, имел равную проницаемость как для Na + и К +. Поскольку она была одинаково проницаема для Na + и K + , Кац предположил, что в результате открытия этих каналов мембранный потенциал сдвинется к 0 мВ. (Значение альфа в уравнении GHK , равное единице, которое при подстановке в уравнение дает потенциал около 0 мВ.)

Рисунок 4.9

Эксперимент, показанный на рисунке слева, проверяет эту концепцию. В мышечную клетку проник регистрирующий электрод, а также другой электрод, который можно подключить к подходящему источнику потенциала для искусственного изменения мембранного потенциала. В норме мембранный потенциал составляет около -80 мВ [Клетки скелетных мышц имеют более высокий (более отрицательный) потенциал покоя, чем большинство нервных клеток. ] Опять же, небольшое количество кураре добавляется, чтобы ПКП был небольшим. Кац заметил в этих экспериментах, что размер ПКП резко менялся в зависимости от потенциала мышечной клетки. Если мембранный потенциал изменить до 0 мВ, никаких изменений потенциала не регистрируется. Если мембранный потенциал сделать +30 мВ, ПКП инвертируется. Таким образом, три разных стимула производят потенциалы замыкательной пластинки, которые сильно отличаются друг от друга.

Особенно информативно отсутствие ответа при потенциале 0 мВ. Подумайте, почему потенциальные изменения не регистрируются. Предположительно, медиатор высвобождается и связывается с рецепторами. Простое объяснение отсутствия изменения потенциала заключается в том, что потенциал, при котором открытие каналов АХ пытается достичь, уже достигнут. Если мембранный потенциал сделать более положительным, чем 0 мВ, ПКП инвертируется. Независимо от потенциала, изменение проницаемости имеет тенденцию сдвигать мембранный потенциал к 0 мВ! Если потенциал покоя более отрицателен, чем 0 мВ, имеет место отклонение вверх. Если он более положительный, имеет место отклонение вниз. Если он уже равен 0 мВ, отклонения нет.

Рисунок 4.10

Этот потенциал также называют реверсивным потенциалом , потому что это потенциал, при котором меняется знак синаптического потенциала. Эксперимент показывает, что в результате связывания АХ с рецепторами специфические каналы становятся одинаково проницаемыми для Na + и К + . Это изменение проницаемости имеет тенденцию перемещать мембранный потенциал из того места, где он был первоначально, в направлении нового потенциала 0 мВ.

Почему нормальный потенциал замыкательной пластинки никогда не достигает 0 мВ? Одна из причин заключается в том, что последовательность изменений проницаемости, лежащих в основе потенциала действия, «заглушает» изменения, вызванные ПКП. Но даже если бы потенциал действия не запускался, ПКП все равно не достигало бы 0 мВ. Это связано с тем, что каналы АХ составляют лишь небольшую часть от общего числа каналов в мышечных волокнах. Также присутствуют каналы K + , которые наделяют мышечную клетку потенциалом покоя. Их работа состоит в том, чтобы поддерживать потенциал покоя клетки.

Канал, открытый ACh, является членом общего класса каналов, называемых лиганд-управляемыми каналами или ионотропными рецепторами . Как показано на рис. 4.10, сайт связывания передатчика является частью самого канала. В результате связывания медиатора с рецептором (обычно необходимы две молекулы) происходит конформационное изменение белка, позволяющее открыть поры и ионам течь по их электрохимическим градиентам. Дополнительные сведения о канале представлены в Главе 11.

 

Проверьте свои знания

  • Вопрос 1
  • А
  • Б
  • С
  • Д

Потенциал замыкательной пластинки в скелетных мышцах
ячейка в принципе может быть вызвана пониженной проницаемостью, к которой
из следующих ионов? (Предположим, что существует конечная начальная проницаемость
к каждому из ионов, перечисленных ниже, и что физиологические градиенты концентрации
присутствуют. ):

    А. Н/Д +

    B. Na + и Ca 2+

    C. Ca 2+

    Д. К +

Потенциал замыкательной пластинки скелетной мышцы
ячейка в принципе может быть вызвана пониженной проницаемостью, к которой
из следующих ионов? (Предположим, что существует конечная начальная проницаемость
к каждому из ионов, перечисленных ниже, и что физиологические градиенты концентрации
присутствуют.):

    A. Na + Этот ответ НЕВЕРНЫЙ.

    Потенциал концевой пластинки представляет собой деполяризацию, которая обычно вызывается одновременным увеличением проницаемости для ионов натрия и калия. Если бы имело место избирательное снижение проницаемости для натрия, такое снижение не привело бы к деполяризации. Скорее, это фактически привело бы к гиперполяризации, потому что альфа в уравнении GHK была бы уменьшена. Отношение проницаемости к натрию и калию будет благоприятствовать проницаемости для калия, сдвигая мембранный потенциал к равновесному потенциалу калия и вызывая гиперполяризацию.

    B. Na + и Ca 2+

    C. Ca 2+

    Д. К +

Потенциал замыкательной пластинки скелетной мышцы
ячейка в принципе может быть вызвана пониженной проницаемостью, к которой
из следующих ионов? (Предположим, что существует конечная начальная проницаемость
к каждому из ионов, перечисленных ниже, и что физиологические градиенты концентрации
присутствуют.):

    А. Н/Д +

    B. Na + и Ca 2+ Этот ответ НЕВЕРНЫЙ.

    Если бы проницаемость для натрия и кальция была снижена, их последствия были бы аналогичны последствиям варианта А. Одно только снижение проницаемости для натрия имело бы тенденцию к гиперполяризации клетки. Точно так же снижение проницаемости для кальция может также привести к гиперполяризации клетки. Потенциал равновесия кальция является очень положительной величиной, и , если бы имелась некоторая тоническая проницаемость в покое для кальция, эта проницаемость способствовала бы тонической деполяризации мембранного потенциала. Следовательно, снижение проницаемости для кальция устранит этот тонический деполяризующий эффект и приведет к гиперполяризации.

    C. Ca 2+

    Д. К +

Потенциал замыкательной пластинки скелетной мышцы
ячейка в принципе может быть вызвана пониженной проницаемостью, к которой
из следующих ионов? (Предположим, что существует конечная начальная проницаемость
к каждому из ионов, перечисленных ниже, и что физиологические градиенты концентрации
присутствуют.):

    А. Н/Д +

    B. Na + и Ca 2+

    C. Ca 2+ Этот ответ НЕВЕРЕН.

    Само по себе снижение проницаемости для кальция может вызвать гиперполяризацию. См. логику ответа на выбор B.

    Д. К +

Потенциал замыкательной пластинки скелетной мышцы
ячейка в принципе может быть вызвана пониженной проницаемостью, к которой
из следующих ионов? (Предположим, что существует конечная начальная проницаемость
к каждому из ионов, перечисленных ниже, и что физиологические градиенты концентрации
присутствуют.):

    А. Н/Д +

    B. Na + и Ca 2+

    C. Ca 2+

    Д. К + Это ПРАВИЛЬНЫЙ ответ!

    Уменьшение калиевой проницаемости может привести к деполяризации, аналогичной потенциалу замыкательной пластинки.


    Опубликовано

    в

    от

    Метки:

    Комментарии

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *